毛细管电泳的概述
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毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是最近几年来发展最快的分析方法之1。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分健身器材性能实验机离, 创建了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。线材弯折实验机线材改变实验机1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦,Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出老化实验机现了第1批毛细管电泳商品仪器。短短几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求,得到了迅速的发展。
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE和高效液相色谱法(HPLC)相箱包路况实验机比,其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作都可自动化, 且2者均有多种不同分离模式。2者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保存时间,CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快;对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的分散系数成正比,对分散系数小的生物大份子而言, 其柱效就要比HPLC高很多;CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 活动相金属疲劳实验机用量也只需几毫升,而HPLC所需样品为μl级, 活动相则需几百毫升乃至更多;但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。
CE和普通电泳相比, 由于其采取高电场,因此分离速度要快很多;检测器则除未能和原子吸取及红外光谱连接之外,其它类型检测器均已和CE实现了连接检测;1般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自动化程度比普通电泳要高很多。总之,CE的优点可概括为3高2少：高灵敏度,经常使用紫外检测器的检测限可汽车v带疲劳实验机达10⑴3～10⑴5mol,激光引诱荧光检测器则达10⑴9～10⑵1mol;高分辨率,其每米理论塔板数为几10万;高者可达几百万乃至千万, 而HPLC1般为几千到几万;高速度, 最快可在60s内完成,在250s内分离10种蛋白质,鞋材实验机 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子; 样品少, 只需nl (10⑼L)级的进样量;本钱低, 只需少许(几毫升)活动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点和分离生物大份子的能力,使CE成为最近几年来发展最迅速的分离分析方法之1。固然CE还是1种正在发展中的技术, 有些理论研究和实际利用正在进行与开发。
“CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道,根据样品中各组分之间淌度和分配行动上的差异而实现分离的1类液相分离技术。(见图16 毛细管电泳仪'>电泳仪器示意图)。其仪器结构包括1个高压电源,1根毛细管, 1个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用大吨位拉伸实验机下,以不同的速度向其所带电荷相反方向软压寿命实验机迁移的现象叫电泳。
CE所用的石英毛细管柱, 3体磨损实验机在pH>3涵道式活塞螺旋桨动力实验机情况下, 其内表面带负电,和溶液接触时构成了1双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引发流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电发动机温度冲击实验机渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流1致,故最早流出;中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度;负离子的运动方向和电渗流方向相反,但因电渗流速度1般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子以后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使全部流体像1个塞子1样以均匀速度向前运动,使全部流型呈近似扁平型的“塞式流”。(见图)它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩大。但在HPLC中,采取的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型,其中心处速度是平均速度的两倍, 致使溶质区带本身扩大, 引发柱效降落, 使其分离效力不如CE。
理论分析表明, 增加速度是减少谱带展宽、提高效力的重要途径,增加电场强度可以提高速度。但高场强致使电流增加, 引发毛细管中电解质产生焦耳热(自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度散布,即管轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度升高呈指数降落, 温度梯度使介质粘度在径向产生梯度, 从而影响溶质迁移速度,使管轴中心的溶质份子要比近管壁的份子迁移得更快, 造成谱带展宽, 柱效降落。
1般来讲温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度,即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。另外, 温度改变使溶液pH值、粘度等产生变化,进1步致使电渗流、溶质份子的电荷散布(包括蛋白质的结构)、离子强度等的改变,造成淌度改变、重复性变差、柱效降落等现象。下降缓冲液浓度可下降电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可禁止蛋白质吸附于管壁,并可产生柱上浓度聚焦效应, 避免峰扩大, 改良峰形。减小管径在1定程度上减缓了由高电场引发的热量积聚, 但细管径使进样量减少,造成进样、检测等技术上的困难。因此,加快散热是减小自热引发的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高100倍。现在有的采取液体冷却方式的毛细管电泳仪可以使用离子强度高达0.5mol/L的缓冲液进行分离, 或使用200 μm直径的毛细管进行微量制备, 仍能到达良好的分离效果和重现性。
CE现有6种分离模式，分述以下：
1. 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又称毛细管自由电泳, 是CE中最基本、利用最普遍的1种模式。前述基本原织物破裂强度实验机理即是CZE的基本原理。
2. 胶束电动毛细管色谱 (micellar electrokineticcapillary chromatography, MECC), 是把1些离子型表面活性剂 (如102烷基硫酸钠, SDS) 加到缓冲液中,当其浓度超过临界浓度后就构成有1疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电, 但1般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度,故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在2相中分配就有差异,疏水性强的胶束结合牢, 流出时间长, 终究按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使CE能用于中性物资的分离, 拓宽了CE的利用范围,是对CE极大的贡献。
3. 毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis,CGE) 是将板上的凝胶移到毛细管中作支撑物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似份子筛的作用, 溶质按份子大小逐1分离。凝胶粘度大,能减少溶质的分散, 所得峰形尖锐, 能到达CE中最高的柱效。经常使用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离、测定蛋白质和DNA的份子量或碱基数, 但其制备麻烦, 使用寿命短。如采取粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺,可构成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分(Non-Gel Sieving)介质。它能避免空泡构成, 比凝胶柱制备简单,寿命长,但分离能力比凝胶柱略差。CGE和无胶筛分正在发展成第2代DNA序列测定仪, 将在人类基因组织计划中起重要作用。
4. 毛细管等电聚焦 (capillary isoelectric focusing,CIEF) 将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小, 以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带,再将样品与两性电解质混合进样, 两端贮瓶分别为酸和碱。加高压(6～8kV)3～5min后,毛细橡胶材料拉伸实验机管内部建立pH梯度,蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦, 构成明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的pH值,使聚焦的蛋白质顺次通过检测器而得以确认。
5. 毛细管等速电泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是1种较早的模式, 采取先导电解质和后继电解质, 使溶质按其电泳淌度不同得以分离, 经常使用于分离离子型物资, 目前利用不多。
6. 毛细管电色谱 (capillary electrochromatography,CEC) 是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中, 以样品与固定相之间的相互作用为分离机制, 以电渗流为活动相驱动力的色谱进程,虽柱效有所降落, 但增加了选择性。此法有发展前景。
毛细管电泳 (CE)除比其它色谱分离分析方法具有效力砖砌体实验机油漆uv加速老化实验机更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、利用面一样广泛等优点外, 其仪器结构也比高效液相色谱 (HPLC)简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前3个部件均易实现, 困难的地方在于检测器。特别是光学类检测器,由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性致使光程太短, 而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想, 因此对检测器灵敏度要求相当高。
固然在CE中也有益于检测的因素, 如：在HPLC中,因稀释之故,溶质到达检测器的浓度1般是其进样端原始浓度的1%, 但在CE中, 经优化实验条件后,可以使溶质区带到达检测器时的浓度和在进样端开始分离前的浓度相同。而且CE中还可采取堆积等技术使样品到达柱上浓缩效果,使初始进样体积浓缩为原体积的1/10～1%, 这对检测10分有益。因阀门简易水压实验机此从检测灵敏度的角度来讲, HPLC具有良好的浓度灵敏度,而CE提供了很好的质量灵敏度。总之, 检测还是CE中的关键问题,有关研究报导很多, 发展也很快。迄今为止,除原子吸取光谱、电感耦合等离子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于CE外,其它检测手段如：紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于CE。
与HPLC类似,CE中利用最广泛的是紫外/可见检测器。按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和2极管阵列或波长扫描检测器两类。前1类检测器采取滤光片或光栅来选取所需检测波长, 优点在于结构简单, 灵敏度比后1类检测器高;后1类检测器能提供时间--波长--吸光度的3维图谱,优点在于在线紫外光谱可用来定性、鉴别未知物。有些商用仪器的2极管阵列检测器还可做到在线峰纯度检查,即在分离进程中即可得知每一个峰含有几种物资;缺点在于灵敏度比前1类略计量用具万能实验机差拉力实验电机动脱色实验机。采取快速扫描的光栅获得3维图谱方式时,其扫描速度遭到机械动作速度的限制。用2极管阵列方式, 扫描速度遭到计算机数据存贮容量大小的限制。由于CE的峰宽较窄,理论上要求能对最窄的峰收集20个左右的数据, 因此要很好地选取扫描频率, 才能得到理想的结果。
毛细管电泳基本原理
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)是810年代后期在全球范围内迅速突起的1种分离分析技术。具有快速、高效、高灵敏度、易定量、重现性好及自动化等优点，已广泛地利用于小份子、小离子、多肽及蛋白质的分离分析研究。它又在核酸分离方面显示出巨大的潜力。电流通过导体时产生焦耳热。传统平板凝胶电泳的最大局限性在于其没法克服两端高电压带来的焦耳热所产生的负面影响。焦耳热可以使筛分介质内部出现温度、粘度及分离速度的不均1，影响迁移、下降效力、使区带变宽。由于这类负面影响与电场强度成正比，所以扭矩轴力联合实验机极大地限制了高电压的引入。也难以提高电泳速度。毛细管电泳使样品在1根极细的柱子中进行分离。细柱可减小电流，使焦耳热的产生减少;同时又增大了散热面积，提高散热效力，大大下降了管中心与管壁间的温差，减少了柱电池振动实验机子径向上的各种梯度差，保证了高效分离。因此可以加大电场强度，到达100～200V/cm，全面提高分离质量。
毛细管电泳的基本装置是1根充满电泳缓冲液的毛细管和与毛细管两端相连的两个小瓶微量样品从毛细管的1端通过“压力”或“电迁移”进入毛细管。电泳时，与高压电源连接的两个电极分别浸人nbs耐磨实验机毛细管两端小瓶的缓冲液中。样品朝与本身所带电荷极性相反的电极方向泳动。各组分因其份子大小、所带电荷数、等电点等性质的不同而迁移速率不同，顺次移动至毛细管输出端附近的光检测器，检测、记录吸光度，并在屏幕上以迁移时间为横坐标，吸光度为纵坐标将各组分以吸300kn液晶显示万能实验机收峰的情势动态直观地记录下来。
