测序引物设计指南-混匀仪技术文章 测序引物设计指南-混匀仪技术文章 测序引物设计指南-混匀仪技术文章测序引物设计指南-混匀仪技术文章 本帖最后由 towersimper 于 2012⑴0⑵5 09:52 编辑 测序引物设计指南 PCR引物设计方法： 1.引物最好在模板cDNA的守旧区内设计。 DNA序列的守旧区是通过物种间类似序列的比较肯定的。在NCBI上搜索不同物种的同1基因，通过序列分析App（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的守旧区。 2.引物长度1般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）经常使用的是18⑵7bp， 测序引物设计指南-混匀仪技术交直流漏电起痕实验机文章
测序引物设计指南-混匀仪技术文章
本帖最后由 towersimper 于 2012⑴0⑵5 09:52 编辑

测序引物设计指南
PCR引物设计方法：
1.引物最好在模板cDNA的守旧区内设计。
DNA序列的守旧区是通过物种间类似序列的比较肯定的。在NCBI上搜索不同物种的同1基因，通过序列分析App（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的守旧区。
2.引物长度1般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）经常使用的是18⑵7bp，但紧缩空气锻球实验机不应大于38，由于太长会致使其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）太高或太低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在1定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度管环拉伸实验机。有效启动温度，1般高于Tm值5~10℃。若按公式T防水拉力实验机m=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最好。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易产生简并，会影响扩增的特异性与效力。
手机屏幕磨擦螺栓轴力改变实验机实验机 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效力胶带初粘实验机存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即便在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效力大大下降，G和C错配的引发效力介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
万能压力实验机 6.碱基要随机散布。
引物序列在模板内应当没有类似性较高，特别是瓶阀水压实验机3’端相jb300b半自动冲击实验机似性较高的序列，否则容易致使毛病引发（Falsepriming）。下降引物与模板类似性的1种方法是，引物中4种碱基的散布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。特别3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区毛病引发。
7.引物本身及引物之间不应存在互补序列。
引物本身不应存在互补序列，否则引物本身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这类2级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物本身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，特别应避免3′真个互补堆叠以避免引物2聚体（Dimer与Crossdimer）的构成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物2聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽可能使其△G值不要太高（应小于4.5kcal/mol）。否则易致使产生引物2聚体带，并且下降引物有电线弯折实验机效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.引物5′ 端和中间△G值应当相对较高，而3′ 端△G值较低。
△G值是指DNA双链构成所需的自由能，它反应了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′真个△G值太高，容易在错配位点构成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6App进行分析）
电液伺服疲劳实验机 9.引物的5′ 端可以修饰，而3′ 端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动车轮轴向疲劳实验机子序列等。
引物的延钢丝绳拉伸实验机伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有构成任何2级结构可能。
10.扩增产物的单链不能构成2级结构。
某些引物无效的主要缘由是扩床垫冲击实验机增产物单链2级结构的影响，选择扩增片断时最好避开2级结构区域。用有关App（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定2级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增常常不能成功。若不能避开这1区域时，用7-deaza⑵′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11pqs60nm高温纯曲折疲劳实验机.引物应具有特异性。
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就能够进行下1步的实验了。
值得1提的是，各种模板的引物设计难度不1。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，致使找不到各种指标都10分适合的引物；用作克隆目的的PCR，由于产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这类情况只能退而求其次，尽可能去满足条件。
做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的1对引物与1般PCR的引物,在引物设计上所要求的参家具综合材料实验机数是不同的。
♦总结：
1)避免重复碱基，特别是G.
2)Tm=58⑹0度。
3）GC=30⑻0%.
4)3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能堆叠。
6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，1般在80⑵50bp之管材压力实验机间都可；80～150bp最为适合（可以延长至300bp）。
7)引物的退火温度要高，1般要在60度以上；
要特别注意避免引物2聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应当斟酌到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应当跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
至于设计App，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应当可以的。
做染料法最关键的就摩擦脱色实验机是寻觅到适合的引物和做污染的预防工作。对引物，你要有从1大堆引物中挑出1两个能用的引物的思想准备---寻觅适合的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应当是通过比对，发现你包装箱实验机所开关寿命实验机设计的这个引物，在已发现电脑插拔力实验机并在GENEBANK中公然的不物种基因序列当中，除和你的目标基因以外，还有无和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列以外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那末这个引物的特异性就很差螺栓拉扭实验机，从而不能用。
转自生命科学论坛